Влияние постоянного освещения и хронической алкогольной интоксикации на структуру митохондрий гепатоцитов крыс Вистар

• Арешидзе Д.А.

Резюме

Актуальность. Одним из наиболее значимых факторов нарушения гомеостаза является нарушение режима "свет-темнота", в частности световое загрязнение, нарушающее эндогенные циркадные ритмы, а также подавляющее ночную секрецию мелатонина эпифизом. Последнее имеет следствием ускоренное старение, развитие онкологических и обменных патологий. Чрезмерное употребление алкоголя остается одной из наиболее значимых социальных проблем как в нашей стране, так и в современном мире в целом. В большей части доступной литературы охарактеризовано влияние действия хронической алкогольной интоксикации и темновой депривации на структуру печени лабораторных животных. Однако нами не обнаружено исследований, посвященных изучению влияния этих факторов на ультраструктурные особенности митохондрий гепатоцитов, что является актуальным в связи с тем, что дисфункции митохондрий играют важную роль в патогенезе многих заболеваний.

Цель - исследовать морфометрические особенности митохондрий самцов крыс стока Вистар в условиях 21-суточной темновой депривации, хронической алкогольной интоксикации и их совместного действия.

Материал и методы. Методами трансмиссионной электронной микроскопии и морфометрии исследована ультраструктура митохондрий гепатоцитов крыс Вистар, подвергнутых темновой депривации, алкогольной интоксикации и совместному действию этих факторов.

Результаты. Установлены количественные и качественные изменения ультраструктуры митохондрий, принципиально отличающиеся при темновой депривации и алкогольной интоксикации как действующего отдельно, так и совместно с темновой депривацией фактора.

Заключение. Проведенное исследование свидетельствует о проявлении гепатопротекторных свойств эпифизарного мелатонина на уровне митохондрий клеток печени, демонстрируя как неблагоприятный эффект его изолированного дефицита, так и усиление токсического поражения печени этанолом в условиях отсутствия этого гормона.

Ключевые слова:трансмиссионная электронная микроскопия; ультраструктурная патология; гепатоцит; митохондрии

К одним из наиболее значимых факторов нарушения гомеостаза относится нарушение режима "свет-темнота", в частности световое загрязнение (темновая депривация) - воздействие света в ночное время [1, 2]. Световое загрязнение нарушает эндогенные циркадные ритмы, а также подавляет ночную секрецию мелатонина эпифизом. Последнее имеет следствием ускоренное старение, развитие онкологических и обменных патологий, а также заболеваний органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и сердечно-сосудистой системы [3, 4].

Установлена взаимосвязь светового загрязнения с нарушением углеводного и липидного обмена, развитием сахарного диабета 2-го типа, атеросклероза, новообразований [5-7]. В частности, световое загрязнение связано с развитием злокачественных новообразований печени, неалкогольной жировой болезни печени, билиарного цирроза и ряда других патологий этого важнейшего органа [8-10].

Чрезмерное употребление алкоголя остается одной из наиболее значимых социальных проблем в современном мире. Хорошо известно, что функции печени - одного из центральных органов, обеспечивающих поддержание гомеостаза, в том числе и ритмостаза, в значительной мере нарушаются при хронической интоксикации алкоголем, вследствие чего получают развитие алкоголь-ассоциированные заболевания [11, 12].

Доказано, что световое загрязнение, в первую очередь антропогенное, лежит в основе возникновения десинхронозов, а также зачастую может явиться причиной развития многих социально значимых заболеваний, в том числе способствовать прогрессированию вызванных алкогольной болезнью нарушений структур и функций органов [13, 14]. Еще в 1981 г. И.Н. Пятницкой была выдвинута гипотеза о том, что в прогрессировании алкогольной болезни существенная роль принадлежит десинхронозу. Это предположение было подтверждено результатами значительного количества исследований [15, 16]. Установлено, что нарушения суточной ритмичности, вызванные алкогольной интоксикацией, имеют решающее значение для развития алкоголь-ассоциированных повреждений печени и играют во многом определяющую роль в тяжести протекания алкогольной болезни [17, 18].

В большей части доступной литературы охарактеризовано влияние действия хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) и темновой депривации как на структуру, так и на циркадные ритмы печени лабораторных животных [19, 20]. Однако нами не обнаружено исследований, посвященных изучению влияния ХАИ и темновой депривации на ультраструктурные особенности митохондрий гепатоцитов, что является актуальным в связи с тем, что дисфункции митохондрий играют важную роль в патогенезе многих заболеваний; в качестве одного из путей биотрансформации мелатонина рассматривают его окисление митохондриальным цитохромом С, а наиболее высокая внутриклеточная концентрация мелатонина обнаружена именно в этих органоидах [20, 21].

Материал и методы

Животные

Работа выполнена на 80 самцах крыс аутбредного стока Вистар в возрасте 6 мес с массой тела 350±15 г. Животные были получены из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА России "Столбовая". Все животные содержались в пластиковых клетках, при температуре 20-22 °С и относительной влажности воздуха 60-70%; первоначально животных содержали при естественном освещении. Крысы имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120-1 (ООО "Лабораторснаб", сертификат соответствия № POCCRU.nO81.B00113, ГОСТ P50258-92). Содержание животных и эксперименты выполнены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). На проведение исследования получено разрешение биоэтического комитета ФГБНУ НИИМЧ им. А.П. Авцына, протокол № 34 (10) от 14.03.2021.

Дизайн исследования

Крысы были случайным образом разделены на 4 группы.

• 1-я группа (контроль, n=20) содержалась при фиксированном световом режиме (свет: темнота/10:14 ч с включением света в 8:00 и выключением в 18:00).

• 2-я группа (экспериментальная, n=20) содержалась в условиях темновой депривации 24 ч в сутки.

• 3-я группа (самцы, n=20) содержалась в тех же условиях, что и животные контрольной группы, но эти крысы получали в качестве питья 15% раствор этанола ad libitum вместо воды, т.е. подвергались ХАИ.

• 4-я группа (самцы, n=20) также содержалась в условиях темновой депривации, животные получали в качестве питья 15% раствор этанола ad libitum.

Длительность эксперимента составила 3 нед.

Выведение крыс из эксперимента осуществляли в углекислотной камере, оборудованной устройством для верхней подачи газа (100% СО₂) в 9:00, 15:00, 21:00 и 3:00. Заполнение объема камеры газом проводили со скоростью 20% в минуту во избежание возникновения у животных диспноэ и боли. Под действием газа животные засыпали, после чего проводился забор крови для определения среднесуточного уровня мелатонина; также осуществлялась эвисцерация печени.

Электронно-микроскопические методы

Образцы печени размером 2 мм³ фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), затем дофиксировали в 1% растворе оксида осмия (OsO₄), обезвоживали в этаноле, в процессе обезвоживания контрастировали 1% уранилацетатом на 70% этаноле и проводили заливку в смесь эпон-аралдит по стандартной методике.

Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме LKB-III (LKB Produkter, Швеция), дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония). Фотофиксация препаратов осуществлялась с помощью камеры Gatan ES500W Erlangshen (Model 782, Gatan Inc., США).

Для микроморфометрической оценки митохондриального аппарата гепатоцитов в каждом препарате анализировали 20 непересекающихся полей зрения при увеличении 20 тыс. и 10 полей зрения при увеличении 50 тыс. (для расчета концентрации внутренних мембран митохондрий, КВММ). Для стандартизации результатов исследования на полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, для анализа выбирали однотипные участки - промежуточную зону печеночных долек.

При помощи программы ImageJ определяли среднюю суммарную площадь сечений митохондрий на 100 мкм² цитоплазмы, среднее количество митохондрий на 100 мкм², среднюю площадь сечения одной митохондрии, средний периметр одной митохондрии, среднюю суммарную длину крист в 1 митохондрии, среднее количество крист в 1 митохондрии, среднюю длину 1 кристы митохондрии, КВММ.

КВММ рассчитывали по формуле:

КВММ = (p + 2l)n,

где p - средний периметр митохондрии, l - средняя длина кристы в одной митохондрии, n - количество митохондрий на единицу площади гепатоцита.

Методы статистической обработки

Построение графиков и статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism v8.41 (США). Для выявления типа распределения использовали тест Д’Агостино-Пирсона. При нормальном распределении использовали t-тест Стьюдента для парного сравнения и тест Тьюки для сравнения 3 групп и более. Отличия групп исследования от контрольной оценивали с помощью теста Даннета. При ненормальном распределении был использован тест Манна-Уитни для парного сравнения и тест Данна для сравнения 3 групп и более. Статистически значимыми считали различия при уровне статистической значимости (α) или вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы ниже 5% (p<0,05). При построении графиков и описании результатов исследования использовали среднее арифметическое и стандартное отклонение. Силу различий обозначали следующим образом: "*" соответствует p<0,05; "**" - p<0,005; "***" - p<0,0005.

Результаты

Ранее проведенные исследования показали, что как темновая депривация и ХАИ, действующие по отдельности, так и совместно, вызывали значительные ультраструктурные изменения гепатоцитов, проявляющиеся наиболее значительно при сочетанном действии двух факторов.

Типичными изменениями являются появление пикнотичных ядер с конденсацией ядерного хроматина, аккумуляция пероксисом, везикуляция эндоплазматической сети (ЭПС), появление значительного количества липидсодержащих вакуолей.

Однако нами были отмечены и признаки репаративной регенерации: новообразовавшиеся в результате репаративного митоза гепатоциты имели характерные признаки в виде округлой формы клеток с крупными светлоокрашенными ядрами, дилатации эндоплазматического ретикулума, мелких митохондрий.

При рассмотрении структуры митохондрий визуально наблюдались их полиморфизм, набухание органоидов, сопровождаемое лизисом их крист и матрикса, наличием неровности наружной мембраны (рис. 1).

В результате микроморфометрических исследований установлено, что все исследованные параметры митохондрий претерпевают достоверные изменения. В частности, отмечено снижение средней суммарной площади митохондрий на единицу площади цитоплазмы, однако происходит увеличение среднего количества этих органоидов на фоне уменьшения средней площади, периметра, количества крист и их длины, а также КВММ (рис. 2).

ХАИ вызвала противоположно направленные изменения. Так, на фоне увеличения площади сечения митохондрий на 100 мкм² цитоплазмы отмечается уменьшение их количества, площади и периметра, однако ни длина крист, ни их количество не изменяются относительно контроля, что также справедливо и в отношении величины КВММ.

Совместное действие темновой депривации и ХАИ вызывает достоверное изменение исследованных параметров относительно как контроля, так и их величин в других экспериментальных группах. В гепатоцитах животных третьей экспериментальной группы на 100 мкм² значительно меньше митохондрий, однако они оказываются существенно крупнее, а в самих митохондриях больше крист, характеризующихся меньшей длиной, что в совокупности обусловливает и существенное снижение КВММ.

Микроморфометрические исследования показали, что темновая депривация вызывает отличные от хронической алкогольной интоксикации и совместного действия этих факторов изменения.

Обсуждение

Изменение структуры митохондрий является одним из первых признаков, возникающих при неблагоприятных воздействиях на клетку. Такого рода изменения отражают функциональные изменения, направленные на адаптацию к изменившимся условиям обмена, или же отражают начало необратимых изменений в строении и функции клетки, приводящих к ее гибели.

Обнаруженные нами ультраструктурные признаки дефицита мелатонина в гепатоцитах являются морфологическими проявлениями нарушения гомеостаза этих клеток печени. Для митохондрий описан широкий спектр функциональных нарушений, возникающих при дефиците мелатонина, однако их структурная основа практически не изучена. Известно, что полиморфизм митохондрий характерен для состояний, связанных с увеличением продукции аденозинтрифосфата и более высокими значениями мембранного потенциала [23]. Кристы митохондрий представляют собой основные функциональные единицы, связанные с преобразованием энергии; их форма, количество и размеры являются маркерами функциональной активности митохондрий [24]. Выраженные изменения в структуре и размерах крист митохондрий в условиях темновой депривации вызваны, по всей вероятности, нарушением трансмембранного транспорта Ca²⁺, контроля цитохрома С и фосфодиэстеразы 1, изменением трансмембранного митохондриального потенциала и разобщением дыхательной цепи митохондрий [25]. Уменьшение числа крист в митохондриях гепатоцитов также рассматривается как один из показателей гипоксии [26]. Кроме того, мелатонин непосредственно влияет на экспрессию некоторых митохондриальных генов, и, несомненно, данный процесс нарушается в условиях дефицита этого гормона, участвуя в развитии описанных изменений.

ХАИ вызывает уменьшение количества митохондрий при одновременном увеличении их размеров. Согласно сложившемуся на сегодняшний день представлению, увеличение линейных размеров носит компенсаторный и/или протекторный характер, а само оно возникает в результате слияния митохондрий и повышает вероятность выживания клетки в условиях гипоксии, индуцированной этанолом. Неизменность структуры внутренней мембраны митохондрий подтверждает этот факт.

Совместное действие ХАИ и темновой депривации вызывает изменения структуры митохондрий, отличные от показателей контроля и первых двух экспериментальных групп. Однако они также оказываются разнонаправленными с изменениями, отмеченными в результате действия темновой депривации. Митохондрии гепатоцитов крыс этой группы оказываются еще больше, чем при раздельном воздействии ХАИ, но при этом их абсолютное количество снижается, также уменьшается длина крист, но возрастает их количество, однако, несмотря на их увеличение, свидетельствующее о росте функциональных потребностей клетки, в этой группе отмечается наименьший КВММ, что отражает наименьшую приспособленность митохондрий этой группы животных к воздействию исследованных факторов.

Заключение

Проведенное исследование свидетельствует о проявлении гепатопротекторных свойств эпифизарного мелатонина на уровне митохондрий клеток печени, демонстрируя как неблагоприятный эффект его изолированного дефицита, так и усиление токсического поражения печени этанолом в условиях отсутствия этого гормона.

Литература/References

1.     Rumanova V.S., Okuliarova M., Zeman M. Differential effects of constant light and dim light at night on the circadian control of metabolism and behavior. Int J Mol Sci. 2020; 21 (15): 5478.

2.     Bumgarner J.R., Nelson R.J. Light at night and disrupted circadian rhythms alter physiology and behavior. Integr Comp Biol. 2021; 61 (3): 1160-9.

3.     Talib W.H., Alsayed A.R., Abuawad A., Daoud S., Mahmod A.I. Melatonin in cancer treatment: current knowledge and future opportunities. Molecules. 2021; 26 (9): 2506.

4.     Han Y., Chen L., Baiocchi L., Ceci L., Glaser S., Francis H., et al. Circadian rhythm and melatonin in liver carcinogenesis: updates on current findings. Crit Rev Oncog. 2021; 26 (3): 69-85.

5.     Aho V., Ollila H.M., Kronholm E., Bondia-Pons I., Soininen P., Kangas A.J., et al. Prolonged sleep restriction induces changes in pathways involved in cholesterol metabolism and inflammatory responses. Sci Rep. 2016; 6: 24828.

6.     Mota M.C., Silva C.M., Balieiro L.C.T., Fahmy W.M., Crispim C.A. Social jetlag and metabolic control in non-communicable chronic diseases: a study addressing different obesity statuses. Sci Rep. 2017; 7 (1): 6358.

7.     Yalçin M., El-Athman R., Ouk K., Priller J., Relógio A. Analysis of the circadian regulation of cancer hallmarks by a cross-platform study of colorectal cancer time-series data reveals an association with genes involved in Huntington’s disease. Cancers (Basel). 2020; 12 (4): 963.

8.     Masri S., Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018; 24 (12): 1795-803.

9.     Nelson R.J., Chbeir S. Dark matters: effects of light at night on metabolism. Proc Nutr Soc. 2018; 77 (3): 223-9.

10. Walker W.H. 2^nd, Bumgarner J.R., Walton J.C., Liu J.A., Meléndez-Fernández O.H., Nelson R.J., et al. Light pollution and cancer. Int J Mol Sci. 2020; 21 (24): 9360.

11. Leggio L., Mellinger J.L. Alcohol use disorder in community management of chronic liver diseases. Hepatology. 2023; 77 (3): 1006-21.

12. Osna N.A., New-Aaron M., Dagur R.S., Thomes P., Simon L., Levitt D., et al. A review of alcohol-pathogen interactions: new insights into combined disease pathomechanisms. Alcohol Clin Exp Res. 2022; 46 (3): 359-70.

13. Berro L.F., España R.A., Mong J.A., Gould R.W. Editorial: sleep and circadian rhythm disruptions associated with substance use disorders. Front Neurosci. 2023; 17: 1165084.

14. Tähkämö L., Partonen T., Pesonen A.K. Systematic review of light exposure impact on human circadian rhythm. Chronobiol Int. 2019; 36 (2): 151-70.

15. Davis B.T. 4^th, Voigt R.M., Shaikh M., Forsyth C.B., Keshavarzian A. Circadian mechanisms in alcohol use disorder and tissue injury. Alcohol Clin Exp Res. 2018; 42 (4): 668-77.

16. Davis B.T. 4^th, Voigt R.M., Shaikh M., Forsyth C.B., Keshavarzian A. CREB protein mediates alcohol-induced circadian disruption and intestinal permeability. Alcohol Clin Exp Res. 2017; 41 (12): 2007-14.

17. Summa K.C., Voigt R.M., Forsyth C.B., Shaikh M., Cavanaugh K., Tang Y., et al. Disruption of the circadian clock in mice increases intestinal permeability and promotes alcohol-induced hepatic pathology and inflammation. PLoS One. 2013; 8 (6): e67102.

18. Bailey S.M. Emerging role of circadian clock disruption in alcohol-induced liver disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2018; 315 (3): G364-73.

19. Areshidze D.A., Kozlova M.A., Makartseva L.A., Chernov I.A., Sinelnikov M.Y., Kirillov Y.A. Influence of constant lightning on liver health: an experimental study. Environ Sci Pollut Res Int. 2022; 29 (55): 83 686-97.

20. Kozlova M.A., Kirillov Y.A., Makartseva L.A., Chernov I., Areshidze D.A. Morphofunctional state and circadian rhythms of the liver under the influence of chronic alcohol intoxication and constant lighting. Int J Mol Sci. 2021; 22 (23): 13007.

21. Fosslien E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Ann Clin Lab Sci. 2001; 31 (1): 25-67.

22. Acuña-Castroviejo D., Martín M., Macías M., Escames G., León J., Khaldy H., et al. Melatonin, mitochondria, and cellular bioenergetics. J Pineal Res. 2001; 30 (2): 65-74.

23. Baker N., Patel J., Khacho M. Linking mitochondrial dynamics, cristae remodeling and supercomplex formation: how mitochondrial structure can regulate bioenergetics. Mitochondrion. 2019; 49: 259-68.

24. Guan Q., Wang Z., Cao J., Dong Y., Chen Y. Mechanisms of melatonin in obesity: a review. Int J Mol Sci. 2021; 23 (1): 218.

25. Guha M., Maity P., Choubey V., Mitra K., Reiter R.J., Bandyopadhyay U. Melatonin inhibits free radical-mediated mitochondrial-dependent hepatocyte apoptosis and liver damage induced during malarial infection. J Pineal Res. 2007; 43 (4): 372-81.

26. Wu J., Danielsson A. Detection of hepatic fibrogenesis: a review of available techniques. Scand J Gastroenterol. 1995; 30 (9): 817-25.