Ассоциация экспрессии генов лигандов иммунных контрольных точек с послеоперационной выживаемостью больных раком желудка

• Мансорунов Д.Ж.
• Кипкеева Ф.М.
• Никулин М.П.
• Алимов А.А.

Резюме

Экспрессия ингибиторных лигандов и рецепторов иммунных контрольных точек в опухоли, как правило, ассоциирована с опухолевой прогрессией, а уровень экспрессии также может рассматриваться в качестве прогностического маркера.

Цель - изучение ассоциации экспрессии генов ингибиторных лигандов иммунных контрольных точек с общей выживаемостью после хирургического лечения рака желудка (РЖ).

Материал и методы. Исследованы парные образцы РЖ (опухоль/норма) от 68 пациентов, которым было проведено хирургическое лечение. Уровень относительной экспрессии генов CD274, CD276, PVR, CEACAM1, LGALS3, LGALS9 был определен с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. Анализ выживаемости проводили с помощью метода Каплана-Майера и модели пропорциональных рисков Кокса.

Результаты. Установлено, что с 3-летней послеоперационной общей выживаемостью больных РЖ ассоциированы стадия по системе TNM (p=0,026), метастазирование в регионарных лимфоузлах (p=0,004), глубина инвазии (p=0,025), степень дифференцировки (p=0,048), а также тип по классификации Lauren (p=0,043). Кроме того, обнаружено, что с выживаемостью связана экспрессия гена PVR (p=0,026). Повышенная экспрессия PVR ассоциирована с лучшей выживаемостью (ОР=0,29; 95% ДИ 0,09-0,98; p=0,047); для остальных исследованных генов ассоциации не обнаружено.

Заключение. На основании проведенного исследования экспрессии генов ингибиторных лигандов иммунных контрольных точек было выявлено, что повышенная экспрессия гена PVR является потенциальным маркером хорошего прогноза для оперированных пациентов с диагнозом "рак желудка".

Ключевые слова:ген; экспрессия; рак желудка; иммунные контрольные точки; прогноз; выживаемость

Рак желудка (РЖ) является 5-м по заболеваемости злокачественным новообразованием, ежегодно в мире диагностируется более 1 млн новых случаев. РЖ занимает 4-е место по смертности среди злокачественных новообразований (около 800 тыс. смертей в год) [1]. В России за 2022 г. было выявлено почти 30 тыс. случаев [2]. Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости и смертности, РЖ остается серьезной проблемой здравоохранения, поскольку 5-летняя общая выживаемость (ОВ) составляет около 20% [3]. Показатели 5-летней ОВ значительно снижаются при метастазировании в регионарные лимфоузлы; при отдаленном метастазировании эти показатели не превышают 10% [4, 5]. Для более точной оценки прогноза онкологического заболевания активно исследуются молекулярные биомаркеры, указывающие на повышенную (или пониженную) вероятность смерти, рецидива либо прогрессирования заболевания в определенной популяции.

Иммунные контрольные точки (ИКТ) - это система молекулярных механизмов, которые регулируют активацию иммунного ответа, препятствуя запуску аутоиммунных процессов, а также модулируют его, уменьшая вызванные иммунными клетками повреждения в органах и тканях [6]. Экспрессия ингибиторных лигандов и рецепторов ИКТ в опухоли, как правило, ассоциирована с опухолевой прогрессией, поскольку от нее зависят противоопухолевый иммунный ответ и развитие опухоли. Поэтому уровень экспрессии ИКТ в опухоли также может быть использован в качестве прогностического маркера. В частности, в метаанализе Z. Qiu и соавт. была выявлена ассоциация повышенной экспрессии PD-L1 с низкой 3- и 5-летней ОВ [HR=1,23, 95% доверительный интервал (ДИ) 1,02-1,49, p=0,028; HR=1,39, 95% ДИ 1,14-1,69, p=0,001 соответственно] [7].

В данной статье мы представляем исследование российской выборки больных, направленное на изучение экспрессии генов ингибиторных лигандов ИКТ CD274, CD276, CEACAM1, PVR, LGALS3 и LGALS9, с целью оценки возможности их использования в качестве прогностических маркеров РЖ.

Материал и методы

В исследование вошли 68 пациентов с РЖ, которым было проведено хирургическое лечение в ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России в период с 09.2016 по 12.2019. Гистологическое исследование удаленного материала проводили согласно рекомендациям 7-го издания классификации Американского объединенного комитета по злокачественным опухолям (American Joint Committee on Cancer, AJCC). Все процедуры с вовлечением пациентов были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения Комитета по биомедицинской этике ФГБНУ "Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова". Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Анализ экспрессии генов

Для выделения тотальной РНК из опухолевой ткани и прилегающей морфологически неизмененной ткани желудка использовали набор RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit ("Евроген", Россия) и случайных гексапраймеров. Реакционную смесь для полимеразой цепной реакции (ПЦР) готовили на основе набора qPCRmix-HS SYBR + HighROX ("Евроген", Россия). При проведении ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) флуоресцентный сигнал регистрировали с использованием прибора QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Последовательности праймеров приведены в табл. 1.

При проведении ПЦР-РВ в качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Расчет уровня экспрессии (RQ) в опухолевой ткани относительно прилегающей морфологически неизмененной ткани желудка осуществлялся с помощью ПО QuantStudio Design and Analysis (Applied Biosystems, США) методом ∆∆Ct.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью ПО Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США) и MedCalc (MedCalc Software Ltd., Бельгия). Непараметрические данные анализировались с использованием точного критерия Фишера. Во всех случаях применяли двусторонний критерий значимости p, статистически значимыми считались различия при уровне р<0,05. ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) был проведен с помощью программы MedCalc, в которой были построены ROC-кривые, определены AUC (Area Under Curve, площадь под ROC-кривой).

Общую выживаемость анализировали от даты операции до даты последнего наблюдения или летального исхода от любой причины. Анализ выживаемости проводили с использованием метода Каплана-Майера. Для оценки статистической значимости различий кривых выживаемости применялся log-rank тест. Анализ факторов, влияющих на ОВ, проводили с помощью модели пропорциональных рисков Кокса.

Результаты

Характеристика выборки

Для исследования были отобраны образцы опухолевой ткани и прилегающей морфологически неизмененной ткани желудка от 68 пациентов. Характеристика выборки представлена в табл. 2. Медиана возраста пациентов составила 61,5 года (от 27 до 81 года). У большинства пациентов опухоль была локализована в теле желудка. В 42 (62%) случаях наблюдалась низкая степень дифференцировки опухоли. Метастазы в лимфатических узлах имели место в 37 (54%) случаях, отдаленные метастазы - в 9 (13%) случаях.

Анализ выживаемости

После проведения хирургического лечения пациентов наблюдали от 1 до 36 мес. Медиана наблюдения составила 29,5 мес. За время наблюдения зафиксировано 27 (39,7%) летальных исходов, выбыли из-под наблюдения (цензурированно) 10 (14,7%) пациентов. Среднее значение времени выживания - 27,6±1,4 мес (95% ДИ 24,9-30,4), медиана ОВ не достигнута. Однолетняя ОВ пациентов после операции составляла 80,9%±4,8%, 2-летняя - 66,5±5,9%, а 3-летняя - 57,4±6,3% (рис. 1).

В рамках проводимого исследования оценивали ассоциацию ОВ с клинико-морфологическими характеристиками, такими как стадия по системе TNM, отдаленное метастазирование, метастазирование в регионарных лимфоузлах, степень дифференцировки, тип по классификации Lauren и глубина инвазии (рис. 2). Как и ожидалось, лучшие показатели ОВ были выявлены при I и II стадии (p=0,026), отсутствии метастазов в лимфатических узлах (p=0,004), глубине инвазии опухоли T1-2 (p=0,025), высокой/умеренной степени дифференцировки опухоли (p=0,048) и кишечном типе по классификации Lauren (p=0,043).

Связь экспрессии генов лигандов иммунных контрольных точек с метастазированием в лимфатических узлах

На следующем этапе исследования была изучена экспрессия генов лигадов ИКТ CD274, CD276, PVR, CEACAM1, LGALS3, LGALS9 методом количественной ПЦР. Для анализа влияния экспрессии генов лигандов ИКТ на процесс метастазирования в лимфоузлах, были выделены группы образцов РЖ без метастазов в лимфоузлах (31 образец) и с их наличием (37 образцов). Были изучены доли образцов с повышенной экспрессией исследованных генов в указанных группах (рис. 3). Повышенным считался уровень экспрессии при значении RQ >2. Показано, что при неметастатическом РЖ повышенный уровень экспрессии чаще всего наблюдался для генов CD276 и LGALS3 (в 42% случаев), реже для генов PVR (29%), CD274 (26%), CEACAM1 (23%) и LGALS9 (23%). В то же время при РЖ с метастазированием в лимфоузлах повышенный уровень экспрессии чаще всего был определен у генов CD276 (в 38% случаев), LGALS3 (35%) и LGALS9 (32%).

Было проведено сравнение уровней экспрессии генов при помощи U-критерия Манна-Уитни, значимые различия уровней экспрессии между группами не обнаружены ни для одного исследованного гена (табл. 3).

Затем было проведено сравнение уровней экспрессии генов в двух группах с использованием ROC-анализа. В результате анализа выявили, что уровни экспрессии исследованных генов не имеют статистически значимых различий между двумя группами для всех генов, площадь под ROC-кривой (AUC) не превышала 0,6, уровень значимости p>0,05.

Таким образом, экспрессия исследованных генов в опухоли не связана с метастазированием в лимфоузлах при РЖ.

Анализ выживаемости по экспрессии генов лигандов ИКТ

Для анализа связи экспрессии 6 генов лигандов ИКТ с ОВ при РЖ применили метод Каплана-Майера. Кривые выживаемости были построены при подразделении больных на группы с уровнем экспрессии генов выше и ниже порогового значения RQ=2 (рис. 4). Оценку статистической значимости различий кривых выживаемости проводили с помощью log-rank теста. Показатели ОВ существенно выше у больных с повышенной экспрессией гена PVR в опухоли по сравнению с пациентами, у которых экспрессия этого гена ниже порога (p=0,026). Для остальных генов связь с ОВ не установлена.

Для определения значимости экспрессии гена PVR в качестве фактора риска смерти больных РЖ был проведен регрессионный анализ с использованием модели пропорциональных рисков Кокса. При РЖ с повышенным (RQ >2) уровнем экспрессии PVR в опухоли риск смерти на 71% ниже в сравнении с пониженной (RQ <2) экспрессией (ОР=0,29; 95% ДИ 0,09-0,98; p=0,047).

Обсуждение

Результаты нашего анализа ОВ больных РЖ после операции соответствуют результатам другого исследования на российской выборке [8]. В настоящей работе впервые было показано, что высокая экспрессия гена PVR может являться благоприятным прогностическим фактором для пациентов с оперированным РЖ. Ген PVR кодирует CD155, молекулу адгезии суперсемейства Ig, участвующую в различных физиологических процессах, таких как пролиферация, миграция, клеточная адгезия и модуляция иммунного ответа [9]. CD155 взаимодействует c ингибиторными рецепторами TIGIT (inhibitory receptors T cell Ig and ITIM domain) и CD96 (TACTILE; T cell-activated increased late expression), что является одной из причин уклонения опухоли от иммунного надзора [10]. CD155 экспрессируется на очень низких уровнях в нормальных клетках, включая иммунные, эпителиальные и эндотелиальные клетки [11]. В то же время экспрессия CD155 повышена во множестве опухолей, она связана с повреждением ДНК и регулируется множеством сигнальных путей, таких как RAF-MEK-ERK-AP-1, NF-κB, Shh и др. В связи с повышенной экспрессией в опухолях и важной ролью в ускользании от иммунного ответа CD155 используется в качестве потенциальной терапевтической мишени, препараты против которой в настоящее время активно разрабатываются [12].

С другой стороны, CD155 взаимодействует с активирующим рецептором CD226 (DNAM-1; the activator receptor DNAX accessory molecule 1), который экспрессируется на поверхности Т- и NK-клеток, что приводит к запуску активирующих сигналов, стимулирующих их цитотоксическую функцию [10]. В экспериментах по химически индуцированному канцерогенезу на мышах отсутствие экспрессии CD226 способствовало более частому развитию опухолей в сравнении с контролем, что подчеркивает важность этого рецептора в противоопухолевом иммунном надзоре [13]. Таким образом, в зависимости от того, с какими рецепторами взаимодействует лиганд CD155, могут активироваться различные сигнальные пути, приводящие либо к уклонению опухоли от иммунного надзора, либо к усилению цитотоксической функции Т- и NK-клеток.

Заключение

Таким образом, в результате проведенного исследования были выявлены особенности экспрессии генов ингибиторных лигандов ИКТ. Показано, что экспрессия гена PVR является потенциальным прогностическим маркером для оперированных больных РЖ. Повышенная экспрессия PVR в опухоли у этих пациентов ассоциирована с лучшими показателями 3-летней выживаемости.

Литература

1.     Sung H., Ferlay J., Siegel R.L., Laversanne M., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA Cancer J. Clin. 2021. Vol. 71, N 3. P. 209-249.

2.     Состояние онкологической помощи населению России в 2022 году. / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. Москва : МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России, 2023.

3.     Ilic M., Ilic I. Epidemiology of stomach cancer // World J. Gastroenterol. 2022. Vol. 28, N 12. P. 1187.

4.     Asplund J., Kauppila J.H., Mattsson F., Lagergren J. Survival trends in gastric adenocarcinoma: a population-based study in Sweden // Ann. Surg. Oncol. 2018. Vol. 25. P. 2693-2702.

5.     Howlader N., Noone A.M., Krapcho M., Garshell J., Neyman N., Altekruse S.F. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2012. Bethesda, MD : National Cancer Institute, 2015.

6.     Боголюбова А.В., Ефимов Г.А., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Иммунотерапия опухолей, основанная на блокировке иммунологических контрольных "точек" ("чекпойнтов") // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 5. С. 395-406.

7.     Qiu Z., Du Y. Clinicopathological and prognostic significance of programmed death ligant-1 expression in gastric cancer: a meta-analysis // J. Gastrointest. Oncol. 2021. Vol. 12, N 1. P. 112.

8.     Коваленко Н.В., Жаворонкова В.В., Иванов А.И., Постолов М.П., Толстопятов С.Е., Джафаров Д.Д. и др. Рак желудка у пациентов моложе и старше 50 лет: характеристики опухолевого процесса, анализ выживаемости // Сибирский онкологический журнал. 2022. Т. 21, № 2. С. 24-37.

9.     Molfetta R., Zitti B., Lecce M., Milito N.D., Stabile H., Fionda C. et al. CD155: a multi-functional molecule in tumor progression // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, N 3. Article ID 922.

10. Paolini R., Molfetta R. CD155 and its receptors as targets for cancer therapy // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24, N 16. Article ID 12958.

11. Zhan M., Zhang Z., Zhao X., Zhang Y., Liu T., Lu L. et al. CD155 in tumor progression and targeted therapy // Cancer Lett. 2022. Vol. 545. Article ID 215830.

12. Zhou R., Chen S., Wu Q., Liu L., Wang Y., Mo Y. et al. CD155 and its receptors in cancer immune escape and immunotherapy // Cancer Lett. 2023. Vol. 573. Article ID 216381.

13. Iguchi-Manaka A., Kai H., Yamashita Y., Shibata K., Tahara-Hanaoka S., Honda S. et al. Accelerated tumor growth in mice deficient in DNAM-1 receptor // J. Exp. Med. 2008. Vol. 205, N 13. P. 2959-2964.